Einfach erklärt
Forschende können jetzt beobachten, wie einzelne Nervenzellen tief im Gehirn von Mäusen arbeiten, ohne das darüberliegende Gewebe zu entfernen. Mit einer neuen Technik sehen sie bis in eine Tiefe von etwa 2 Millimetern und fangen bei gleicher Laserleistung deutlich mehr Licht auf als bisher. Das eröffnet neue Möglichkeiten, aber längst nicht alle Bereiche des Gehirns sind damit erreichbar.
Licht dringt im lebenden Gehirn nur schwer in tiefe Bereiche vor. Es wird im Gewebe gestreut, sodass sich die Signale der untersuchten Zellen mit einem störenden Hintergrund vermischen. In manchen Experimenten mussten Forschende deshalb Gewebe über dem Zielgebiet entfernen, um die Zellen besser sehen zu können. Eine neue Plattform eines Teams der Rockefeller University ermöglicht nun einen tieferen Blick auf die Aktivität von Nervenzellen in Mäusen, ohne die darüberliegende Hirnrinde abzutragen.
Die Tiefe ist nicht das einzige Problem
Die Herausforderung besteht aus zwei Teilen. Je tiefer das Licht ins Gehirngewebe eindringt, desto stärker wird es gestreut. Dadurch lässt sich immer schwerer erkennen, von welcher Zelle ein Fluoreszenzsignal stammt. Einfach mehr Licht einzusetzen, ist aber keine sichere Lösung: Eine höhere mittlere Laserleistung kann das Gewebe erwärmen und schädigen. Gesucht ist deshalb ein aussagekräftiges Signal, ohne die sicheren Belichtungsgrenzen zu überschreiten.
Fluoreszenzmikroskope nutzen Moleküle, die Licht aussenden, wenn sie angeregt werden. In der Hirnforschung können solche Signale zeigen, wie aktiv Zellen sind – etwa indem sie Veränderungen des Kalziums in Nervenzellen sichtbar machen. Gestreutes Licht erzeugt jedoch einen störenden Hintergrund, der das gesuchte Signal überlagern kann. Je weiter die Zellen von der Gehirnoberfläche entfernt liegen, desto ausgeprägter wird dieses Problem und desto schwieriger ist es, die Aktivität einzelner Zellen zu messen.
Die Drei-Photonen-Mikroskopie bietet hier einen möglichen Vorteil: Sie erzeugt weniger Fluoreszenzhintergrund als die Zwei-Photonen-Mikroskopie und könnte daher grundsätzlich tiefere Einblicke ermöglichen. Damit dieser Vorteil zum Tragen kommt, müssen die Laserpulse allerdings stark genug sein, um ein messbares Signal hervorzurufen. So entsteht ein Zielkonflikt: Das Ziel ist, tiefer zu sehen, ohne das Gewebe zu gefährden. Ihn zu lösen, war nicht einfach eine Frage höherer Energie oder der Anpassung eines einzelnen Bauteils.
Das gesamte Bildgebungssystem neu abstimmen
Statt das Mikroskop als Gerät mit feststehenden Einstellungen zu behandeln, überprüfte das Team von Alipasha Vaziri, Leiter des Laboratory of Neurotechnology and Biophysics an der Rockefeller University, wie die einzelnen Komponenten zusammenspielen. Die Forschenden nannten ihre Plattform TrUDI – kurz für ultratiefe Drei-Photonen-Bildgebung. Die Ergebnisse erschienen in der Fachzeitschrift Nature Methods. In der Studie ging es darum, die Aktivität ganzer Gruppen von Nervenzellen mit einer Auflösung aufzuzeichnen, die einzelne Zellen erkennen lässt, und zwar in etwa 2 Millimetern Tiefe.
Mit Computermodellen leitete das Team Änderungen am Laser, an der Optik und an der Signalaufnahme ab. Es ging nicht nur darum, eine möglichst große Tiefe zu erreichen. Entscheidend war vielmehr, die Eigenschaften der Anregungspulse, die Ausbreitung und Erfassung des Lichts sowie die Geschwindigkeit und den räumlichen Umfang der Aufnahmen aufeinander abzustimmen. Auch die Grenzen einer sicheren Laserbelichtung mussten berücksichtigt werden – ebenso wie die nötige Genauigkeit, um Veränderungen des Kalziums einzelnen Zellen zuordnen zu können.
Der entscheidende Gedanke: Die Leistung des Systems hängt nicht von einem einzigen Bauteil ab. Der Laser muss zur Optik passen, und die Art des Abtastens und Aufzeichnens muss auf die zeitlichen Abläufe der Nervensignale abgestimmt sein. Werden diese Komponenten nicht gemeinsam optimiert, können nützliche Photonen verloren gehen oder unerwünschte Beleuchtungseffekte zunehmen, selbst wenn jedes Teil für sich effizient arbeitet. Das Team verbesserte deshalb das System als Ganzes, statt lediglich eine vertraute Einstellung zu verändern.
Stärkeres Signal – ohne mehr Laserleistung
Das wichtigste quantitative Ergebnis der Studie: Mit TrUDI ließen sich bei gleicher Laserleistung etwa 250-mal so viele Fluoreszenzphotonen nachweisen wie mit früheren Methoden. Das ist bedeutsam, weil mehr erfasste Photonen mehr Informationen über das Signal liefern. Die Lösung bestand also nicht einfach darin, die mittlere Laserleistung zu erhöhen – und damit möglicherweise auch die Erwärmung oder Schädigung des Gewebes in Kauf zu nehmen.
Das bedeutet nicht, dass jedes Signal in jeder Hirnregion gleichermaßen stärker geworden ist oder dass nun alle Bereiche des Gehirns sichtbar sind. Vielmehr sorgte das abgestimmte Zusammenspiel der Komponenten dafür, dass unter den Bedingungen der Plattform mehr Fluoreszenzlicht aufgefangen werden konnte. So ließ sich die Aktivität einzelner Zellen auch in einer Tiefe erkennen, die zuvor nur schwer zu erreichen war. Ob eine aussagekräftige Messung gelingt, hängt weiterhin davon ab, wo aufgenommen wird, welche optischen Eigenschaften das Gewebe hat und welche Sicherheitsgrenzen gelten.
Zusätzlich entwickelten die Forschenden ein Verfahren, mit dem sich gezielt die untersuchten Zellen anregen lassen, statt das gesamte Sichtfeld fortlaufend zu beleuchten. Dabei schaltet sich der Laser ein, wenn der Scan über zuvor ausgewählte Zellen läuft; außerhalb dieser Bereiche wird er anders eingesetzt. Die gezielte Anregung macht den Umgang mit dem Licht selektiver. Sie ergänzt die weiteren Optimierungen, mit denen das Signal verbessert und zugleich die Lichtmenge im Gewebe berücksichtigt werden soll.
Von bisher 1,2 Millimetern Tiefe auf nahezu 2 Millimeter
Vor dieser Arbeit reichten funktionelle Aufnahmen mit der Drei-Photonen-Mikroskopie bis in eine Tiefe von ungefähr 1,2 Millimetern. Damit blieben sie unter der theoretisch möglichen Reichweite der Technik von mehr als 2 Millimetern. Die Ergebnisse mit TrUDI zeigen, dass sich diese größere Reichweite durch eine gemeinsame Optimierung von Laser, Optik und Signalaufnahme besser ausschöpfen lässt. Die bisherigen Leistungen müssen also nicht als unüberwindbare Grenze gelten.
Das Team testete die Plattform an Mäusen und zeichnete die Aktivität von Nervenzellgruppen in der Großhirnrinde und im Hippocampus in etwa 2 Millimetern Tiefe auf. Das Sichtfeld umfasste rund 230 × 230 Quadratmikrometer, die Aufzeichnungsrate lag bei 8,6 Hertz. Diese Werte machen deutlich, worin die Leistung besteht: Es geht nicht nur darum, eine tiefe Hirnstruktur als unbewegtes Bild darzustellen. Vielmehr lässt sich die veränderliche Aktivität von Nervenzellen in einem begrenzten Bereich und mit einer angegebenen zeitlichen Auflösung verfolgen.
Diese Angaben sind wichtig, um einzuordnen, was das Gerät tatsächlich leisten kann. Ein Sichtfeld von 230 × 230 Quadratmikrometern deckt nur einen vergleichsweise kleinen Gewebebereich ab; die Aufzeichnungsrate von 8,6 Hertz gibt an, wie häufig Daten erfasst werden. Die Technik zeigt also weder das ganze Gehirn auf einmal noch zeichnet sie jedes neuronale Ereignis ohne Einschränkungen auf. Sie ermöglicht es, Zellgruppen an tiefliegenden Stellen zu untersuchen – innerhalb räumlicher und zeitlicher Grenzen, die bei der Planung von Experimenten berücksichtigt werden müssen.
Warum es wichtig ist, die Hirnrinde zu erhalten
Wird für die Untersuchung eines tiefliegenden Bereichs das darüberliegende Gewebe entfernt, verändert sich die Umgebung, in der das Zielgebiet arbeitet. Dadurch kann auch der Vergleich mit einem Gehirn ohne solchen Eingriff schwieriger werden. Aufnahmen durch die darüberliegenden Gewebeschichten bieten eine Möglichkeit, bestimmte tiefe Schaltkreise zu beobachten und die Hirnrinde dabei intakt zu lassen. Das verhindert nicht alle Auswirkungen eines Experiments, erweitert aber die Möglichkeiten, Aktivität ohne Entfernung des darüberliegenden Gewebes zu untersuchen – sofern das Licht das Zielgebiet erreichen kann.
Diese Fähigkeit könnte helfen zu verstehen, wie Gruppen von Nervenzellen ihre Aktivität über tiefe Hirnregionen hinweg koordinieren. Statt die Beobachtung auf die Gehirnoberfläche zu beschränken, können Forschende Zellen in der Großhirnrinde und im Hippocampus in größerer Tiefe verfolgen und ihre gleichzeitigen Aktivitätsänderungen im verfügbaren Sichtfeld untersuchen. Die Plattform ist dabei ein neues Messwerkzeug, keine Erklärung der Funktion neuronaler Schaltkreise. Sie kann jedoch Daten liefern, die präzisere Fragen und Experimente ermöglichen.
Eine bestimmte erreichbare Tiefe bedeutet nicht, dass alle Strukturen in dieser Tiefe zugänglich sind. Form und Lage einer Region sowie die Eigenschaften des umliegenden Gewebes beeinflussen, ob sie sich abbilden lässt. Vaziri wies darauf hin, dass Teile des Striatums mit dieser Methode weiterhin nicht erreichbar sind. Für einige noch tiefer gelegene Kerne sind zudem invasive Verfahren erforderlich. Die Angabe von nahezu 2 Millimetern ist daher kein Versprechen, dass sich jedes beliebige Ziel im Gehirn mit dem Gerät untersuchen lässt.
Was die Studie zeigt – und was noch offen ist
Die Arbeit belegt, dass sich die Tiefenbildgebung verbessern lässt, indem die Bestandteile eines Systems neu aufeinander abgestimmt werden – und nicht nur, indem man den Laser stärker einstellt. Bei TrUDI wurden die Eigenschaften der optischen Anregung mit den Möglichkeiten der Optik und der Art der Datenerfassung verknüpft. Zugleich berücksichtigte das Team die Signalqualität sowie thermische, zeitliche und räumliche Grenzen. Dieser Ansatz ermöglichte es, mehr Fluoreszenzlicht zu erfassen und in lebenden Mäusegehirnen Zellen in etwa 2 Millimetern Tiefe aufzuzeichnen.
Die Ergebnisse bedeuten jedoch weder, dass die Technik alle anderen Verfahren zur Hirnbildgebung ersetzen kann, noch dass sich bei jedem Experiment invasive Eingriffe vermeiden lassen. Einige tiefe Zielgebiete liegen weiterhin außerhalb der nachgewiesenen Reichweite, Teile des Striatums sind nicht zugänglich, und die Aufnahmen erfolgen innerhalb eines begrenzten Sichtfelds und mit einer bestimmten Aufzeichnungsrate. Der Wert der Plattform liegt darin, den Bereich zu vergrößern, den Licht erreichen kann, und dabei die Hirnrinde über den untersuchten Stellen zu erhalten – nicht darin, sämtliche technischen Grenzen aufzuheben.
Welche nächsten Schritte folgen, hängt davon ab, ob die Methode konkrete Fragen zur Funktionsweise des Gehirns beantworten kann und für weitere Regionen und Versuchsaufbauten geeignet ist. Die Studie zeigt zunächst, dass sich die theoretische Grenze der Drei-Photonen-Bildgebung durch sorgfältig geplante, aufeinander abgestimmte Verbesserungen annähern lässt – und dass dies an Mäusen erprobt werden konnte. Ob sich die Methode auch für noch tiefere Ziele oder andere Versuchsbedingungen eignet, lässt sich aus den bisher vorliegenden Zahlen allein nicht ableiten.
Fazit
Das Team des Laboratory of Neurotechnology and Biophysics an der Rockefeller University hat mit TrUDI eine Plattform entwickelt, die die Aktivität von Nervenzellen tief im Gehirn von Mäusen sichtbar macht, ohne die darüberliegende Hirnrinde zu entfernen. Durch die abgestimmte Optimierung von Laser, Optik und Aufzeichnung ließen sich bei gleicher Laserleistung etwa 250-mal so viele Fluoreszenzphotonen erfassen. Die Forschenden zeichneten die Aktivität mit einer Auflösung auf, die einzelne Zellen erkennen lässt, und zwar in etwa 2 Millimetern Tiefe – verglichen mit rund 1,2 Millimetern bei früheren Aufnahmen. Die Tests umfassten die Großhirnrinde und den Hippocampus; das Sichtfeld betrug 230 × 230 Quadratmikrometer, die Aufzeichnungsrate 8,6 Hertz. Das erweitert die Möglichkeiten der Hirnforschung, macht aber längst nicht alle tiefen Hirnregionen zugänglich. Für manche Bereiche bleiben invasive Verfahren nötig.